• | Печать |

Цель работы: провести электронномикроскопическое исследование биологических образцов как в режиме низкого вакуума, так и в режиме высокого вакуума с нанесением проводящего покрытия.

Теоретический материал

Применение РЭМ для исследования образцов биологического происхождения

Биологические материалы обладают высоким электрическим сопротивлением, поэтому они быстро заряжаются под действием пучка электронов. Кроме того, наблюдается радиационное повреждение поверхности (пузыри, кратеры, сморщивание, темные квадраты растра, утрата частей образца).

Биологические образцы могут быть различными – толстые и тонкие срезы, влажные и обезвоженные образцы, массивные и одноклеточные, замороженные. Для каждой группы используются свои методы пробоподготовки и наблюдения в электронном микроскопе.

В данной работе исследованию подвергаются высушенные (сухие) массивные образцы различной морфологии и происхождения.

Для предотвращения излишней зарядки и повреждения образцы можно исследовать в режиме низкого вакуума, либо наносить на их поверхность тонкое проводящее покрытие, способствующее стоку излишнего зарядка с их поверхности.

Работа с образцами в режиме низкого вакуума

Установить образец (бумага, ткань, резина), добиться высокого вакуума.

Нажать Low Vacuum в панели управления вакуумом (рисунок 1). При этом режим вакуума перейдет из высокого в низкий и будет выполняться откачка камеры образцов.

Установить ускоряющее напряжение 15кВ

Установить в камере образца давление в 30 Па (для влагосодержащих образцов 50-70 Па) . Нажать кнопку Start для откачки.

Исследование проводить в отраженных электронах (BEIW ).

При исследовании необходимо учитывать взаимосвязь параметров давления, зарядки и яркости (рисунок 2)

Рисунок 1 – Панель управления вакуумом

Рисунок 2 – Взаимосвязь параметров давления, зарядки и яркости

Нанесение проводящих покрытий

Многие образцы являются диэлектриками и не проводят электрический ток, а для отвода с поверхности электрического заряда, образующегося при электронной бомбардировке, их требуется напылять электропроводным слоем, использовать низкие рабочие напряжения, либо режим работы в низком вакууме.

Наиболее подходящий элемент – углерод, имеющий минимальный рентгеновский спектр, причем с низкой энергией.

Но он не идеален вследствие низкого выхода вторичных электронов. Поэтому предпочтительнее использовать металл с высоким выходом вторичных электронов, т.е. золото или золото-палладиевый сплав (с тонкой зернистой структурой). Однако такое напыление не очень пригодно для рентгеноспектрального анализа в отраженных электронах.

В таблице 1 приведен выбор материала покрытия в зависимости от цели исследования.

В данной работе предлагается использовать напыление металла для исследования морфологии биологических объектов в режиме высокого вакуума.

Метод ионного напыления в низком вакууме используется для получения проводящих слоев из благородных металлов на образцах для РЭМ (рисунок 3). С помощью форвакуумного насоса откачивается воздух до давления 10 Па. На мишень подается высокое напряжение, в камере начинается газоразрядный процесс и мишень из металлической фольги бомбардируется атомами воздуха или аргона, которые выбивают из нее атомы металла. Эти атомы осаждаются на поверхности образца и образуют слой металла, толщина которого определяется током разряда и временем напыления. Для подавления разогрева образца ( при бомбардировке их электронами) катод и анод располагают коаксиально, над которыми располагают также коаксиально магнит (устройство магнетронного типа).

Таблица 1 – Выбор материала покрытия

Рисунок 3 – Ионное напыление в низком вакууме

Для получения покрытия оптимальной толщины при работе на приборе магнетронного типа (рисунок 4) используются номограммы, приведенные на рисунке 5.

Рисунок 4 – Устройство напыления магнетронного типа производства компании JEOL

Рисунок 5 – Номограммы определения толщины покрытия для различных типов мишеней

Примеры электронных изображений биологических материалов

а)

б)

в)

Рисунок 6 – Электронные изображения биологических объектов: а) мелованная бумага. б) пыльца розы, в) поверхность насекомого

Вопросы для допуска к лабораторной работе

• Какие особенности при наблюдении биологических образцов в РЭМ
• Наблюдение биологических образцов в режиме низкого вакуума
• Нанесение проводящих покрытий
• Диапазон увеличений при наблюдении биологических образцов

Сценарий лабораторной работы

• Ознакомиться с теоретическим материалом к работе и Правилами техники безопасности
• Включить РЭМ
• Установить и закрепить биологический образец
• Наблюдение биологических образцов в режиме низкого вакуума
• Извлечение образца
• Напыление проводящего покрытия на биологический образец
• Наблюдение биологического образца после напыления проводящего покрытия в режиме высокого вакуума
• Извлечь образец
• Выключить РЭМ
• Составить отчет по работе.

Контрольные вопросы

1. Опишите пробоподготовку биологических образцов, которые были исследованы в работы.
2. Опишите принципы выбора режимов исследования в работе.
3. Опишите порядок пробоподготовки и особенности наблюдения образца – срез стебля растения или структура ветви дерева.